什么是PCR？

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR polymerase chain reaction)技術(shù)是一種完美的體外無(wú)限擴(kuò)增核酸的技術(shù)。首先將DNA模板、引物(primer)、Taq酶、緩沖液、dNTP(A、T、C、G四種堿基)等混合均勻，加熱至一定溫度（94℃)使模板失去活性，雙鏈解離，形成單鏈DNA，這個(gè)過(guò)程稱之為DNA的變性(melting or denaturation)；然后降溫至一定溫度(55℃)，使引物和DNA模板復(fù)性，兩者發(fā)生特異性結(jié)合，此階段稱之為退火(annealing)；最后再加熱到一定的溫度(72℃)，使Taq酶活性達(dá)到最大，在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈，此過(guò)程稱之為延伸(extension)。這三個(gè)階段可概括為：高溫變性——低溫退火——中溫延伸。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán)，每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍，一般樣品是經(jīng)過(guò)30次循環(huán)，最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見(jiàn)到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。

PCR微流控芯片的優(yōu)勢(shì)

第一代PCR是PE-Cetus公司的熱循環(huán)儀。第二代是靜態(tài)的微反應(yīng)槽PCR芯片(micro chamber PCR chip)。第三代PCR技術(shù)是PCR微流控芯片。 

下面我們從反應(yīng)體積大小,循環(huán)時(shí)間的長(zhǎng)短等幾個(gè)方面對(duì)這三類PCR技術(shù)做個(gè)比較。 

通過(guò)表1的對(duì)比,我們可以看出PCR微流控芯片較前兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是:在保證一定擴(kuò)增效率的前提下,反應(yīng)體積可變,樣品的輸入和輸出是連續(xù)的,反應(yīng)從靜態(tài)變?yōu)閯?dòng)態(tài);反應(yīng)時(shí)間縮短。

PCR微流控芯片的分類

PCR微流控裝置主要可分為反應(yīng)池內(nèi)固定擴(kuò)增式PCR(Chamber stationary PCR microfluidics),連續(xù)流動(dòng)式PCR(Continuous-flow PCR microfluidics)和熱對(duì)流驅(qū)動(dòng)PCR(Thermal convection-driven PCR microfluidics)三種形式。

 1. 反應(yīng)池內(nèi)固定擴(kuò)增式PCR 

是傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增的微型化,其反應(yīng)速度仍然受PCR反應(yīng)體系的熱容、反應(yīng)池襯底材料的熱容、加熱器以及傳感器的熱容等因素制約,因此需要對(duì)PCR系統(tǒng)的熱容優(yōu)化以便縮短反應(yīng)時(shí)間和減少能量消耗。 

一種反應(yīng)池內(nèi)固定擴(kuò)增式PCR示意圖 

2. 連續(xù)流動(dòng)式PCR   

DNA樣品和反應(yīng)試劑連續(xù)流動(dòng)經(jīng)過(guò)三個(gè)不同的恒溫帶,從而達(dá)到DNA片段熱循環(huán)擴(kuò)增的目的,該方法由于不需要反復(fù)地加熱或冷卻PCR裝置,加熱-冷卻速度一般不受PCR裝置系統(tǒng)的熱容所限制,反應(yīng)速度較快。

一種連續(xù)流動(dòng)式PCR示意圖

3. 熱對(duì)流驅(qū)動(dòng)PCR 

是基于Rayleigh-Be?nard對(duì)流原理。這種裝置不需要借助外   熱對(duì)流驅(qū)動(dòng)PCR力只需要浮力就能驅(qū)動(dòng)PCR試劑流經(jīng)不同的溫度區(qū)，跟前兩種相比，這種芯片制造簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，而且具有更快的溫度傳導(dǎo)速度，更易于集成。

一種熱對(duì)流驅(qū)動(dòng)PCR示意圖