作者：張洋子

當(dāng)傳染性病毒傳播時(shí)，最好的解決方案是快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出傳染因子并分離載體以防止進(jìn)一步傳播。因此，開發(fā)合適的快檢工具，迅速篩查具有各種病毒綜合征類型的患者并根據(jù)所鑒定的病毒采取必要的措施則是十分必要的。

目前，快速免疫分析已經(jīng)解決了基于抗體的酶聯(lián)免疫測(cè)定方法的時(shí)間問(wèn)題并提高了便利性，但仍然具有抗體依賴性問(wèn)題并且準(zhǔn)確性差。同時(shí)，高靈敏度、高準(zhǔn)確度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中最廣泛使用的檢測(cè)方法。然而，該檢測(cè)系統(tǒng)依賴于PCR儀實(shí)現(xiàn)升降溫且檢測(cè)成本較高,不適合在現(xiàn)場(chǎng)及發(fā)展中國(guó)家普及。因此，考慮到將等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（Rolling circleamplification, RCA）集成到微流體平臺(tái)中，可以有效解決上述問(wèn)題。

基于此，韓國(guó)高麗大學(xué)的Sehyun Shin教授及其團(tuán)隊(duì)研制出一種新的微流體裝置（圖1），該裝置主要由一個(gè)樣品池、一個(gè)填充有瓊脂糖微珠的多通道以及一個(gè)注射器三部分組成。用于填充的瓊脂糖微珠已提前修飾上進(jìn)行RCA反應(yīng)的引物，當(dāng)含有病原體靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)入混合有RCA反應(yīng)體系及墨水的樣品池，首先與其中的模板結(jié)合，形成封閉的啞鈴型RCA模板，隨后逐漸流入對(duì)應(yīng)的微通道內(nèi)，與引物雜交后開始RCA反應(yīng)，一段時(shí)間后，充分?jǐn)U增的DNA產(chǎn)物彼此纏結(jié)在微珠表面形成DNA水凝膠，促使微珠表面積顯著增加，相應(yīng)的橫截面流動(dòng)面積減小，從而阻止液體在微珠之間進(jìn)一步流動(dòng)（圖2）。注射器用于產(chǎn)生具有死體積的可變真空壓力。由于與樣品體積（25 μL）遠(yuǎn)小于死體積（4.1mL），因此整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中新產(chǎn)生的真空壓力不會(huì)發(fā)生顯著變化，從而不會(huì)對(duì)多通道之間造成任何干擾。

圖1 （a）實(shí)驗(yàn)裝置；（b）微珠填充微通道的示意圖；（c）微珠填充微通道內(nèi)顯微鏡圖像。

圖2  利用瓊脂糖微珠通過(guò)RCA反應(yīng)形成DNA水凝膠示意圖

研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)微珠的選擇以及引物修飾效果進(jìn)行了優(yōu)化。如圖3所示，首先將引物分別修飾在聚苯乙烯微珠和瓊脂糖微珠，經(jīng)過(guò)洗滌后，再加入修飾有熒光基團(tuán)FAM的探針，使其與修飾在微珠上的引物互補(bǔ)配對(duì)，再次洗滌后通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。對(duì)二者的熒光強(qiáng)弱可以明顯看出，引物修飾在瓊脂糖微珠上效果更好。此外，還使用分別修飾有兩種引物的微珠進(jìn)行RCA反應(yīng)，瓊脂糖微珠表面獲得的水凝膠量更多，再次證明其較聚苯乙烯微珠更適用于本實(shí)驗(yàn)。經(jīng)分析，瓊脂糖微珠具有一定的彈性，裝載進(jìn)入微通道離心后會(huì)發(fā)生形變，使微珠能夠最大化的充滿整個(gè)通道內(nèi)，有助于RCA反應(yīng)生成的產(chǎn)物更快達(dá)到阻隔染料前進(jìn)的目的。

圖3  驗(yàn)證引物分別固定在聚苯乙烯微珠和瓊脂糖微珠上

隨后，確定了這一裝置檢測(cè)病原體的檢測(cè)范圍。如圖4a所示，當(dāng)樣品中沒(méi)有靶標(biāo)時(shí)，不會(huì)促發(fā)RCA反應(yīng)，因此，在微通道內(nèi)沒(méi)有任何堵塞，此時(shí)的基本流動(dòng)阻力為3.65 kPa，即檢測(cè)的背景值。將垂直軸上的壓力定義為打破微通道內(nèi)微珠間形成DNA水凝膠的臨界壓力。當(dāng)靶標(biāo)病原體以0.01 pM的濃度存在時(shí)，通過(guò)微通道所需的壓力略微增加，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p?<?0.05）。進(jìn)一步升高病原體濃度至0.1 pM時(shí)，臨界真空壓力與對(duì)照組出現(xiàn)顯著差異（p <0.05）。隨著濃度繼續(xù)增大，與對(duì)照組的差異更為明顯。由此，首先計(jì)算出吸入壓力為5.06 Pa，即作為截至臨界壓力，并在此基礎(chǔ)上建立了濃度與壓力的校準(zhǔn)曲線，計(jì)算出檢出限LOD為0.019 pM。

將病原體DNA濃度固定在1 pM，微通道內(nèi)微珠填充管的長(zhǎng)度固定在20 mm的條件下進(jìn)一步優(yōu)化了RCA反應(yīng)的時(shí)間。如圖4b 所示，在RCA反應(yīng)15 min后出現(xiàn)顯著差異（p<0.05）。20分鐘后，臨界壓力與對(duì)照組（0分鐘）存在顯著性差異（p <0.001）。各種病原體的LOD和檢測(cè)時(shí)間相似。經(jīng)分析，這些通過(guò)肉眼檢測(cè)獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前的相關(guān)研究報(bào)道比較，最短時(shí)間從2小時(shí)減少到僅需15分鐘。

圖4 （a）病原體DNA濃度與施加壓力的關(guān)系；（b）孵育時(shí)間與施加壓力的關(guān)系（*:p?<?0.05, **: p?<?0.001）。

在優(yōu)化好的條件下，將研制的裝置用于實(shí)際樣品可行性檢測(cè)中。如圖5所示，樣品1含有埃博拉病毒和寨卡病毒病原體，因此墨水僅通過(guò)相應(yīng)的通道。相類似的，包含登革熱和MERS病毒的樣品2也在此對(duì)應(yīng)的微通道內(nèi)發(fā)生RCA反應(yīng)形成DNA水凝膠實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。因此，本系統(tǒng)可以選擇性地和靈敏地可視化檢測(cè)混合傳染性病毒樣品。

圖5 使用微流控芯片進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)的結(jié)果（a）樣品1：登革熱和MERS；（b）樣品2：埃博拉和寨卡病毒。

點(diǎn)評(píng)：

1. 該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種微流控裝置，通過(guò)在微通道中填充的數(shù)千個(gè)微珠表面上形成DNA水凝膠，阻斷珠子之間形成的流動(dòng)路徑，將靶標(biāo)濃度與裝置內(nèi)的壓力建立關(guān)系，實(shí)現(xiàn)15分鐘內(nèi)輕松準(zhǔn)確并且無(wú)需使用任何電動(dòng)儀器或設(shè)備即可檢測(cè)多種傳染性病毒。

2. 研究中巧妙地設(shè)計(jì)了啞鈴型模板用于RCA反應(yīng)，且將RCA用于微流控快速檢測(cè)裝置中的反應(yīng)時(shí)間大大縮短，在現(xiàn)場(chǎng)篩查中有望進(jìn)一步應(yīng)用。

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