近幾年來，微全分析系統(tǒng)技術日益受到人們關注,廣泛應用于生化分析和細胞學研究領域。μTAS技術應用于細胞學研究的一個重要發(fā)展方向是開發(fā)細胞培養(yǎng)微系統(tǒng),用于細胞遷移,細胞分化貝藥物篩選等。與常規(guī)細胞體外培養(yǎng)技術相比,利用細胞培養(yǎng)微系統(tǒng)培養(yǎng)細胞能夠較好地模擬細胞體內(nèi)生長的微環(huán)境。然而,在設計細胞培養(yǎng)芯片時,必須考慮芯片材料的生物兼容性、培養(yǎng)液流動導致的機械力對細胞的影響和有效成分的傳遞輸送等因素其中,如何通過簡單快速的微細加工工藝加工生物兼容性良好的材料，是需要解決的首要問題。

目前用于加工細胞培養(yǎng)芯片的材料主要有硅、玻璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS等聚合物材料）。PDMS芯片通常采用復制壓模技術制作",能夠實現(xiàn)微米級圖案的高保真復制,并且具有良好的生物兼容性,可直接培養(yǎng)各類細胞。但PDMS是彈性材料，易受有機試劑作用產(chǎn)生微通道變形、溶脹等現(xiàn)象;且PDMS管道表面為疏水性,很難潤濕親水性溶液,在培養(yǎng)液進樣過程中容易產(chǎn)生氣泡而損傷細胞。

與PDMS材料相比,玻璃材質芯片具有良好的親水性能、力學性能,且制作設備與傳統(tǒng)集成電路(IC)工藝設備相兼容。但目前制作玻璃芯片，是在玻璃基底上濺射一層金屬或多晶硅等薄膜材料作為刻蝕掩模層,然后進行濕法或干法刻蝕,最后在超凈環(huán)境中利用高電壓或高溫進行鍵合同整個加工工藝復雜，價格昂貴。

為了綜合利用玻璃材料和PDMS材料的優(yōu)點，我們提出了一種基于玻璃濕法腐蝕過程中的鉆蝕效應叫,廉價、快速地制作玻璃細胞培養(yǎng)芯片的方法。以商品化的氧化銦錫透明導電玻璃為芯片基質，以一層AZ4620光刻膠作為玻璃刻蝕的掩模層,以BOE液為玻璃腐蝕液,通過上膠、曝光、顯影、腐蝕、去膠、鍵合等步驟獲得細胞培養(yǎng)芯片。其中,蓋片仍采用PDMS材料,以利用它的透氣性特質。采用ITO玻璃有利于集成加熱系統(tǒng),滿足細胞長期觀察和記錄細胞活動的需要。最后,將該芯片與溫度控制系統(tǒng)、視頻觀察系統(tǒng)等整合,培養(yǎng)豬髂骨動脈內(nèi)皮細胞,證實了該方法的可行性和系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 材料

細胞培養(yǎng)芯片的基質材料為商品化的ITO玻璃;刻蝕掩模層采用正性光刻膠AZ4620(AZ photoresist products美國):PDMS單體為Sylgard184 Dow Coming美國);細胞培養(yǎng)芯片加工過程中所用化學試劑均為分析純產(chǎn)品,玻璃腐蝕液為BOE液。

1.2微流控芯片的加工

以 ITO玻璃為基質材料的細胞培養(yǎng)芯片制作主要包括掩膜板制作、ITO玻璃清洗,曝光、刻蝕、鍵合等步驟,見圖1。

圖1 玻璃芯片的制作過程

1.2.1掩模板制作 芯片掩模板如圖2所示。進樣孔1、3之間距離為14mm,用于導入細胞,管道狹窄處寬度為200μm,其他為細胞培養(yǎng)區(qū)域，寬度為800 μm:2.4間管道為培養(yǎng)液導入通道,寬150 μm,總長14mm。培養(yǎng)液通道和細胞培養(yǎng)區(qū)域之間距離為190μm,用于加工后續(xù)的壩型”結構。

1.2.2 ITO玻璃清洗 將ITO玻璃先用丙酮和酒精超聲清洗,再用去離子水沖洗干凈,放入130C的烘箱中烘烤1h，去除附著在玻璃表面的水蒸汽。

1.2.3曝光、顯影 ITO玻璃的一側已濺射一層厚度為35mm的ITO薄膜,其功能為導電發(fā)熱,另一側則與普通玻璃無異。在沒有 ITO薄膜的玻璃一側甩涂AZ4620光刻膠。甩膠結束,將ITO玻璃置于80C烘箱內(nèi)軟烘30min此時光刻膠厚度為6~7μm。軟烘結束,利用光刻機對玻璃基底進行紫外曝光。曝光后的ITO玻璃用顯影液AZ400K顯影，顯影過程中不斷晃動ITO玻璃,使顯影液與被曝光的感光膠充分接觸,加速感光膠和基底的分離。顯影至被曝光部分的光刻膠完全去除為止。

1.2.4刻蝕 將顯影完成后的ITO玻璃置于130C的烘箱中硬烘30min硬烘過程可以降低光刻膠與玻璃基底的殘余應力,蒸發(fā)去除光刻膠內(nèi)的有機溶劑，增加光刻膠掩模層與玻璃基底表面的黏附力。由于ITO薄膜耐腐蝕效果較差,其在以50:503比例配置的HO HCIHNO腐蝕液中耐受時間約為40s因此,在硬烘完成,進行濕法腐蝕之前,需要對玻璃基底的ITO薄膜進行保護,以避免在刻蝕過程中BOE液將此薄膜腐蝕去除。保護方法如圖1⑤所示,將PDMS單體和固化劑以10：1混合均勻,脫氣處理后澆注在ITO薄膜一側，80C固化1h待固化完成,將此玻璃基底置于BOE腐蝕液中進行刻蝕，刻蝕過程中通過磁力攪拌器不斷攪拌,以形成所需要的微管道結構。腐蝕完畢,去除用于保護作用的PDMS薄層,即得到已刻蝕好微管道的玻璃基片,如圖3所示。

1.2.5 PDMS 薄膜蓋片制作將PDMS單體與固化劑按10:1的比例均勻混合后,脫氣處理。將脫氣處理后的PDMS澆注在水平放置的載玻片上，80℃固化1h。固化完成,切割成合適的大小用于后續(xù)與玻璃基片的鍵合。PDMS薄膜厚度為1mm。

1.2.6 鍵合 刻蝕完成后的玻璃基片上的通道為開放性結構，將其與其他平整表面鍵合即可形成密閉的培養(yǎng)通道。將此玻璃基片與上一步驟制得的PDMS薄膜置于等離子體刻蝕儀內(nèi)，抽真空后通入氧氣,施加射頻電壓,取出玻璃基片和PDMS薄膜，小心粘合即完成兩者的不可逆鍵合。

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