1.2 血細(xì)胞分離和采集

血細(xì)胞分離和采集是從全血中把某種特定類型的血細(xì)胞(如紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等)分離、純化并進(jìn)行采集, 在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究以及血液疾病臨床診斷和治療中具有非常重要的作用。通過微流控芯片裝置可以對少量血樣快速、高效地檢測并分離出不同種類的血細(xì)胞。目前, 以微流控芯片為研究平臺的血細(xì)胞分離采集方法主要有2種:(1)以細(xì)胞微結(jié)構(gòu)和物理/力學(xué)特性為基礎(chǔ)的細(xì)胞被動(dòng)分離; (2)通過在微流控通道中施加外加力場驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分離。

1.2.1 以血細(xì)胞微結(jié)構(gòu)和物理/力學(xué)特性為基礎(chǔ)的細(xì)胞分離

流體流動(dòng)時(shí), 在黏彈性效應(yīng)和慣性效應(yīng)作用下, 大顆粒將向靠近側(cè)壁的橫向位置遷移。類似地, 當(dāng)血液在血管中流動(dòng)時(shí), 尺寸較小的柔性紅細(xì)胞將遷移至血管中間區(qū)域, 而尺寸較大的剛性白細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞將向血管壁周圍遷移。利用這一特殊的血流動(dòng)力學(xué)特征, 一些課題組設(shè)計(jì)了微流控芯片用于分離并采集不同類型的血細(xì)胞。例如, Liu等基于細(xì)胞物理特性和流體黏彈性效應(yīng)設(shè)計(jì)了一種微流控芯片, 不同大小的細(xì)胞在微流道內(nèi)流動(dòng)至不同的通道:紅細(xì)胞匯聚在中間通道, 而腫瘤細(xì)胞在兩側(cè)通道內(nèi)富集[28], 成功實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞的完全分離。此外, 他們通過改變作用于囊泡的流體力, 成功實(shí)現(xiàn)了外泌體從胞外囊泡的分離采集。類似地, Zhang等利用該方法實(shí)現(xiàn)了紅細(xì)胞與血漿的加速分離。Hou等設(shè)計(jì)了一種可以控制液體流動(dòng)的微流控芯片, 通過不同的管道設(shè)計(jì)與流速調(diào)節(jié)改變微流道內(nèi)的流體力學(xué)特征, 進(jìn)而利用血細(xì)胞在大小、形狀及剛?cè)崃W(xué)特性的不同, 從微量血液樣品中分離出了特定的血細(xì)胞, 包括瘧疾感染的紅細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞及不同種類的白細(xì)胞, 最終達(dá)到了檢測的目的。

圖 8 基于慣性效應(yīng)和黏彈性效應(yīng)設(shè)計(jì)的微流控裝置用于特定類型血細(xì)胞的分離采集。(a)微流道內(nèi)瘧疾感染紅細(xì)胞和健康紅細(xì)胞的分離; (b)微流道內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞、白細(xì)胞和紅細(xì)胞的分離

1.2.2 通過在微流控通道中施加外加力場驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞分離

通過在微流控通道中施加外加力場驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分離的方式主要包括介電電泳力驅(qū)動(dòng)、磁場作用力驅(qū)動(dòng)、超聲波驅(qū)動(dòng)等3種。

(1) 介電電泳力驅(qū)動(dòng)。介電電泳技術(shù)描述的是位于非均勻電場的中性微粒由于介電極化的作用而產(chǎn)生的平移運(yùn)動(dòng)。當(dāng)處于非均勻電場中時(shí), 血細(xì)胞產(chǎn)生極化現(xiàn)象, 其表面會產(chǎn)生偶極矩, 進(jìn)而在介電電泳力的作用下, 向更強(qiáng)的電場強(qiáng)度方向移動(dòng)(陽性介電電泳)或者更弱的電場強(qiáng)度方向移動(dòng)(陰性介電電泳)。由于血細(xì)胞所受介電電泳力的大小取決于血細(xì)胞的大小和形狀、以及懸浮媒介的介電性質(zhì)和黏度特性等因素, 因此在微流控芯片上進(jìn)行介電電泳可實(shí)現(xiàn)血細(xì)胞的分離。介電電泳細(xì)胞分離技術(shù)具有無需標(biāo)記、無需表面修飾和特異性高的特點(diǎn), 因此, 以微流控芯片介電電泳為基礎(chǔ)的分離采集技術(shù)在血細(xì)胞分離領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。例如, Nascimento等利用微流控介電電泳實(shí)現(xiàn)了受寄生蟲感染的紅細(xì)胞與健康紅細(xì)胞的分離采集。當(dāng)紅細(xì)胞受到寄生蟲感染后, 其細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)和表面抗原會發(fā)生一定程度的變化, 同時(shí), 細(xì)胞膜通透性也會有一定程度的增強(qiáng), 導(dǎo)致感染紅細(xì)胞和健康紅細(xì)胞在介電場中所受介電電泳力的方向和大小都有不同, 進(jìn)而遷移至不同的微通道, 實(shí)現(xiàn)分離采集的目的。

(2) 磁場作用力驅(qū)動(dòng)。對目標(biāo)血細(xì)胞用微型磁珠進(jìn)行磁性標(biāo)記, 被磁性標(biāo)記的血細(xì)胞流經(jīng)磁場區(qū)域時(shí), 磁場作用力使目標(biāo)血細(xì)胞偏離原來的運(yùn)動(dòng)軌道。不同大小和磁化率的血細(xì)胞流經(jīng)梯度磁場時(shí)所受磁場作用力不同從而實(shí)現(xiàn)分離采集。例如, Karabacak等利用慣性效應(yīng)及磁場效應(yīng)設(shè)計(jì)了一種微流控芯片裝置, 成功實(shí)現(xiàn)了對純循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離富集。這套微流控裝置前半部分的微通道內(nèi)布滿了傾斜的微柱陣列, 尺寸小的紅細(xì)胞/血小板和尺寸大的白細(xì)胞/癌細(xì)胞在微柱陣列中受到慣性升力不同而分離至不同的微通道(圖 9(a))。接下來, 白細(xì)胞和癌細(xì)胞的懸浮液經(jīng)過中間微通道流經(jīng)磁場區(qū)域, 在磁場作用力和流體驅(qū)動(dòng)力的共同驅(qū)動(dòng)下流向不同的收集通道, 從而將低濃度的癌細(xì)胞從白細(xì)胞中分離出來(圖 9(a))。Zhao等利用磁流體對不同類型細(xì)胞的作用力不同設(shè)計(jì)了2種微流控裝置(圖 9(b)), 實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞/紅細(xì)胞的分離。另外, 利用磁流體方法可測量紅細(xì)胞在磁性介質(zhì)中的懸浮情況, 進(jìn)而評估紅細(xì)胞的變形性能。例如, Tasoglu等將紅細(xì)胞浸入溶液里, 然后注入夾在2個(gè)磁體中間的毛細(xì)管中。磁力從毛細(xì)管底部到頂部垂直減小, 因此紅細(xì)胞的最終平衡位置由細(xì)胞的密度確定。這種方法可以區(qū)分并分離健康和被感染的紅細(xì)胞。

圖 9 微流控通道中細(xì)胞分離示意圖。(a)~(b)基于慣性升力和磁場效應(yīng)從微量血液樣品中實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和血細(xì)胞的分離采集; (c)~(d)通過超聲波微流控裝置從血細(xì)胞混合液中分離腫瘤細(xì)胞

(3) 超聲波驅(qū)動(dòng)。對通過微通道的流體施加一定角度的聲波, 其產(chǎn)生的壓力可推動(dòng)懸浮在液體中的顆粒移動(dòng)。與正常的血細(xì)胞相比, 聲波對癌細(xì)胞的推力更大, 故可將腫瘤細(xì)胞推到單獨(dú)的微通道。例如, Ding等人設(shè)計(jì)了一個(gè)外加表面聲波的微流控裝置實(shí)現(xiàn)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離捕獲。這套微流控裝置的兩端裝有2個(gè)產(chǎn)生聲波的傳感器(圖 9(c))。當(dāng)兩股聲波相遇時(shí), 產(chǎn)生的壓力能推動(dòng)細(xì)胞移動(dòng)。他們利用此方法從乳腺癌患者的血液中成功檢測到極為罕見的腫瘤細(xì)胞。Collins等使用高頻聚焦表面聲波垂直作用于流體, 進(jìn)而推動(dòng)流體流動(dòng)并在微通道中產(chǎn)生流體渦流。他們利用流體渦流形成的渦旋實(shí)現(xiàn)了多種不同尺寸顆粒的分離捕獲, 并從紅細(xì)胞和癌細(xì)胞混合液中成功捕獲了乳腺癌細(xì)胞(圖 9(d))。基于微流控超聲波驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞分選具有無需配體、無需標(biāo)記和生物兼容的特點(diǎn), 同時(shí), 由于每個(gè)細(xì)胞僅在不到1 s的時(shí)間內(nèi)經(jīng)歷聲波, 因此, 與其他細(xì)胞分離捕獲技術(shù)相比, 該技術(shù)顯得更為溫和, 對分離血細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)大大降低。

1.3 血細(xì)胞機(jī)械疲勞損傷

軟物質(zhì)材料會在長期的循環(huán)應(yīng)變作用下發(fā)生損傷和斷裂, 也就是機(jī)械疲勞。類似的, 在生物細(xì)胞中, 例如紅細(xì)胞, 在循環(huán)應(yīng)力的作用下也會產(chǎn)生機(jī)械疲勞。Du及其合作者基于介電電泳技術(shù)設(shè)計(jì)了一種包含振幅調(diào)制電極的微流控芯片, 研究了循環(huán)機(jī)械應(yīng)變下單個(gè)紅細(xì)胞的機(jī)械疲勞損傷行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在一定的循環(huán)載荷下, 紅細(xì)胞會產(chǎn)生機(jī)械疲勞效應(yīng); 同時(shí), 在相同的累積加載時(shí)間和相同的最大載荷下, 動(dòng)態(tài)循環(huán)載荷比靜態(tài)載荷對紅細(xì)胞膜的損傷更大。此外, 他們發(fā)現(xiàn)不同的載荷形態(tài)(如方波載荷、擬正弦波載荷等)對紅細(xì)胞膜損傷的影響程度也有所不同:與擬正弦波載荷實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比, 循環(huán)方波載荷對紅細(xì)胞膜機(jī)械變形影響更為顯著。他們還發(fā)現(xiàn)機(jī)械疲勞效應(yīng)會導(dǎo)致磁滯和能量耗散, 持續(xù)的機(jī)械疲勞對血細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性和生物學(xué)功能有著不利影響。這樣的疲勞測試平臺可用來定量表征血液循環(huán)過程中單個(gè)血細(xì)胞累積的細(xì)胞膜損傷, 幫助人們了解血細(xì)胞的應(yīng)力波動(dòng)對其生物力學(xué)特性的影響。

2 總結(jié)及展望

紅細(xì)胞變形性能對血流性質(zhì)有重大影響, 它是決定高切率下血液黏率的關(guān)鍵因素。許多血液病變是由于紅細(xì)胞變形性能低下導(dǎo)致的。例如, 瘧疾感染紅細(xì)胞和貧血癥下鐮狀紅細(xì)胞的變形性能會減弱, 不利于紅細(xì)胞通過狹窄毛細(xì)血管; 遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥下球形紅細(xì)胞由于體表比增加進(jìn)而使紅細(xì)胞很難變形。目前, 人們已發(fā)展一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)來研究病變紅細(xì)胞的變形性能及生物力學(xué)響應(yīng), 然而, 在單細(xì)胞水平研究紅細(xì)胞的變形和流動(dòng)特征仍面臨很大挑戰(zhàn)。近些年來迅速發(fā)展的微流控芯片技術(shù)憑借其特有的優(yōu)勢為健康與疾病中的紅細(xì)胞力學(xué)性能研究提供了一個(gè)很好的平臺。隨著微流控芯片技術(shù)的不斷發(fā)展, 如何模擬更復(fù)雜的幾何形態(tài)和更逼真的血流微環(huán)境, 把血細(xì)胞形狀的動(dòng)態(tài)變化和各種疾病的病理變化及臨床表現(xiàn)聯(lián)系起來, 將是未來工作的一個(gè)重點(diǎn)和難點(diǎn)。

同時(shí), 基于微流控芯片技術(shù)的器官芯片(Organ-on-a-chip)近幾年來發(fā)展迅速, 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了體外模擬多種活體細(xì)胞、組織及器官微環(huán)境。為適應(yīng)人類器官及血管的復(fù)雜性, 未來的研究需要建立更加復(fù)雜的多器官微流控芯片(Multi-organ-on-a-chip)系統(tǒng), 將不同器官芯片模型應(yīng)用到類似人體的血液循環(huán)環(huán)境中。目前熱門的3D生物打印技術(shù)具有精確的控制能力和個(gè)性化特點(diǎn), 使得"定制"人體組織器官成為可能。通過在芯片上打印特定帶血管的器官, 可以更好地模擬細(xì)胞、血管及組織微環(huán)境并建立患者特異化(Patient-Specific)的血管及器官模型, 進(jìn)而從細(xì)胞-組織-器官等不同層面多尺度探索相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制, 并進(jìn)行更加系統(tǒng)的藥物毒性檢測和藥效評估。

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