1247年（我國(guó)南宋理宗淳祜七年），時(shí)任湖南提點(diǎn)刑獄兼大使行府參議官的宋慈編寫(xiě)完結(jié)《洗冤集錄》，這是世界歷史上第一本以逝世方法體系修改的法醫(yī)學(xué)作品。

《洗冤集錄》開(kāi)頭曰：“事莫大于人命，罪大莫于死刑，殺人者抵法故無(wú)恕，施刑失當(dāng)心則難安，故成指定獄全憑死傷檢驗(yàn)。倘檢驗(yàn)不真，死者之冤未雪，生者之冤又成，因一命而殺兩命數(shù)命，仇報(bào)相循慘何底止。”故法醫(yī)最重要的工作便是提供醫(yī)學(xué)上的證據(jù)，協(xié)助檢察官、辦案者找出司法案件的真相，還原事實(shí)，保障死傷者的人權(quán)。

在現(xiàn)代，隨著科學(xué)技能的開(kāi)展，法醫(yī)學(xué)已經(jīng)成為一個(gè)復(fù)雜的開(kāi)放系統(tǒng)，積極地吸收著來(lái)自數(shù)學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、心理學(xué)以及計(jì)算機(jī)科學(xué)與工程的常識(shí)，集現(xiàn)代科學(xué)技能體系于大成。特別是DNA檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)展和應(yīng)用，為法醫(yī)學(xué)帶來(lái)了一場(chǎng)技能革命。

1985年英國(guó)Leicester大學(xué)遺傳學(xué)部教授A.J.Jeff reys發(fā)現(xiàn)并建立了DNA指紋圖的查驗(yàn)辦法，于當(dāng)年成功地判定了一宗英國(guó)移民糾紛案件。經(jīng)過(guò)對(duì)遺傳物質(zhì)DNA的序列多態(tài)性及長(zhǎng)度多態(tài)性的查驗(yàn),即可實(shí)現(xiàn)個(gè)別辨認(rèn)及親權(quán)判定，該技術(shù)正在成為當(dāng)前法醫(yī)證據(jù)判定最主要的技術(shù)手段，被廣泛地運(yùn)用于刑事犯罪偵辦和親權(quán)爭(zhēng)議處理。

《中國(guó)測(cè)試》2017年7月刊發(fā)的《法醫(yī)DNA快速查驗(yàn)研究進(jìn)展》，為國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)課題和公安部技能研究方案項(xiàng)目?jī)?nèi)容，就國(guó)內(nèi)外法醫(yī)DNA-STR快速查驗(yàn)的研究進(jìn)展和效果，別離從快速提取、快速擴(kuò)增、快速設(shè)備、快速試劑與快速設(shè)備相結(jié)合四大方面臨有關(guān)DNA快速查驗(yàn)概略的技能辦法和試驗(yàn)原理進(jìn)行了充分說(shuō)明和舉例證明，并對(duì)該行業(yè)在快速查驗(yàn)辦法的挑選提出清晰的建議。

法醫(yī)DNA快速查驗(yàn)技能是目前研討的熱門(mén)，首要應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別和親子鑒定范疇。該文分別從快速提取，快速擴(kuò)增，快速設(shè)備，微流控芯片，全自動(dòng)DNA分型檢測(cè)設(shè)備方面臨現(xiàn)有DNA快速查驗(yàn)的技術(shù)方法，試驗(yàn)原理進(jìn)行充分說(shuō)明和舉例論證，一起對(duì)該行業(yè)在快速查驗(yàn)辦法的挑選問(wèn)題上提出明確的主張——選用強(qiáng)抑制力的緩沖系統(tǒng)，高效酶并結(jié)合快速擴(kuò)增程序完成快速PCR檢測(cè)技術(shù)，一起提出芯片化DNA檢測(cè)的完成方法，指出國(guó)產(chǎn)的便攜式全自動(dòng)快速檢測(cè)儀器是未來(lái)開(kāi)展的首要方向。

微流控芯片技術(shù)又稱(chēng)微全分析系統(tǒng)（miniaturized total analytical system，μTAS），是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過(guò)程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動(dòng)完成分析全過(guò)程。由于它在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的巨大潛力，已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、電子、材料、機(jī)械等學(xué)科交叉的嶄新研究領(lǐng)域。近年來(lái)諸多學(xué)者基于微流控芯片技術(shù)的角度，對(duì)涉及快速檢驗(yàn)芯片DNA提取、芯片PCR擴(kuò)增、毛細(xì)管芯片電泳及集成式芯片均進(jìn)行了深入的研究。

在芯片DNA提取技術(shù)方面，國(guó)內(nèi)研究最多的是以二氧化硅微球?yàn)檩d體的固相提取，它是M48磁珠法和硅珠法提取DNA的微型化。原理如下：以二氧化硅微球、磁性微球等介質(zhì)作為DNA的固相載體，首先采用高離子鹽液進(jìn)行DNA吸附、有機(jī)溶劑洗脫，最后使用低離子緩沖液洗脫DNA。如2010年Duarte[21]報(bào)道了基于固相萃取原理的玻璃材質(zhì)DNA提取芯片，如圖 1所示，腔室的大小1.5 cm×1.4 mm×200 μm，以確保預(yù)提取的DNA溶液量恒定；在磁場(chǎng)作用下整個(gè)腔室充滿(mǎn)磁性微球和鹽酸胍（GuHCl），整個(gè)裝置完成DNA的提取和純化。Cady等[22]也報(bào)道了基于固相萃取原理的DNA提取芯片，硅珠、sol-gel等固相載體填充于芯片中，實(shí)現(xiàn)了血樣等的DNA提純。陳興等[23]驗(yàn)證了在多孔氧化硅芯片和普通芯片上進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)，多孔氧化硅芯片提取DNA的效率更高。目前各種聚合物基底如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）等由于價(jià)格低廉、加工方便已經(jīng)被成功用于DNA提取系統(tǒng)。如2007年劉慣超等[24]制作的塑料基（PMMA）的DNA提取芯片表明:經(jīng)過(guò)溶膠涂漬、在內(nèi)表面制作二氧化硅層的芯片能夠?qū)崿F(xiàn)從血液中提取DNA。王聿佶等[25]采用PDMS（聚二甲基硅氧烷）芯片，能對(duì)生物樣品中的DNA進(jìn)行有效快速提取，并且在30 min內(nèi)完成PCR產(chǎn)物的提純。國(guó)外還有報(bào)道基于pH誘導(dǎo)的靜電吸附DNA提取，基于UV活化的聚碳酸酯表面的DNA提取[26]，基于納米多孔過(guò)濾膜的DNA提取。

芯片PCR擴(kuò)增與普通PCR擴(kuò)增儀相比，擴(kuò)增速度有明顯優(yōu)勢(shì)。普通臺(tái)式PCR擴(kuò)增儀的產(chǎn)物擴(kuò)增管升降溫度總是遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于擴(kuò)增儀腔本身的溫度，而芯片PCR則具有明顯優(yōu)勢(shì)。Heidi Giese報(bào)導(dǎo)對(duì)比普通臺(tái)式PCR儀器和微流控芯片使用SpeedSTAR試劑對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，普通臺(tái)式PCR儀器擴(kuò)增所用時(shí)間為145.1 min，芯片PCR的擴(kuò)增所用時(shí)間為19.6 min，遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于普通臺(tái)式PCR儀器。采用升降溫速率性能佳的PCR擴(kuò)增儀可以明顯縮短PCR的擴(kuò)增時(shí)間，同樣，提高芯片溫度控制是實(shí)現(xiàn)芯片PCR快速擴(kuò)增的關(guān)鍵，代表性的研究有Hagan等以非接觸的紅外加熱方式進(jìn)行熱循環(huán)擴(kuò)增，結(jié)合SpeedSTARTDNA聚合酶，僅在45 min內(nèi)完成就完成了16個(gè)STR位點(diǎn)在微芯片上的擴(kuò)增。Mathies小組[30]則以接觸式溫度控制方式實(shí)現(xiàn)芯片上PCR的快速擴(kuò)增，同時(shí)證明了芯片PCR-CE的可行性。此外微機(jī)電技術(shù)和溫度傳感器等方面的研究也證明了可以縮短芯片PCR擴(kuò)增時(shí)間。

普通臺(tái)式PCR儀器與芯片PCR的擴(kuò)增對(duì)比

芯片毛細(xì)管電泳具有進(jìn)樣量少，靈敏度高，分析速度快等特點(diǎn)，非常適合法醫(yī)DNA-STR的快速檢驗(yàn)。毛細(xì)管電泳芯片由于尺寸小，可施加較大場(chǎng)強(qiáng)，所以在幾秒鐘內(nèi)就可完成對(duì)樣品的分離，微陣列毛細(xì)管電泳芯片可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)則成為目前學(xué)者研究的熱點(diǎn)。2002年Emrich CA等[31]報(bào)道的將高通量384孔毛細(xì)管陣列微電泳芯片集成在半徑僅為8 cm的圓盤(pán)上，7 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)384份樣品的檢測(cè)；2006年Yeung等制作的高通量96孔毛細(xì)管陣列微電泳芯片可在30 min內(nèi)同時(shí)實(shí)現(xiàn)96個(gè)樣本檢驗(yàn)，這些均進(jìn)一步顯示了微芯片技術(shù)在DNA-STR快速分析方面的巨大潛力和優(yōu)勢(shì)。為了防止樣品間發(fā)生交叉污染，降低成本，可以構(gòu)建一次性的塑料材質(zhì)的微整列電泳平臺(tái)。

集成式芯片是當(dāng)前微流控芯片研究的核心，如Hagan等[29]將DNA提取和RCR擴(kuò)增集于一塊芯片上，通過(guò)采用固相提取，使用快速啟動(dòng)DNA聚合酶及紅外加熱方式，在45 min內(nèi)完成了口腔拭子的提取和PCR擴(kuò)增；Roux等[33]將芯片PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)集成在一次性的塑料芯片上，通過(guò)非接觸式紅外加熱方法僅在7 cm芯片上完成了電泳分離；季旭等[34]研制的一種集成PCR反應(yīng)室與毛細(xì)管電泳CE的生物芯片，將硅片上制造的通過(guò)電阻加熱的凹槽作為擴(kuò)增池，在擴(kuò)增池下游設(shè)計(jì)制造毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，并通過(guò)紫外光等檢測(cè)器判斷結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)了樣品擴(kuò)增、電泳分離和紫外光檢測(cè)的單片集成。Liu等將特定DNA模板的純化、PCR擴(kuò)增、進(jìn)樣以及電泳全集成于一張微流控芯片上，并可在3 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本DNA的檢驗(yàn)（如圖 3所示），該全集成芯片原理結(jié)構(gòu)為兩個(gè)完全相同的分析系統(tǒng)在4 in（1 in=2.54 cm）玻璃晶片上形成對(duì)稱(chēng)的雙峰，每個(gè)分析系統(tǒng)包括聚二甲基硅氧烷（PDMS）微泵和兩個(gè)PDMS微型閥用于流體控制，首先通過(guò)4 cm長(zhǎng)的珠捕獲結(jié)構(gòu)用于DNA分叉通道系統(tǒng)模板的捕獲。圖 3（b）為加熱器和電阻溫度檢測(cè)器（RTD），用于控制250 nL PCR室的擴(kuò)增。圖 3（c）為500 mm長(zhǎng)的雙T通道錐形結(jié)構(gòu)，用于控制PCR的純化和進(jìn)樣，24 cm和14 cm長(zhǎng)的通道用于CE分離，同時(shí)這兩個(gè)系統(tǒng)共享陽(yáng)極、陰極，進(jìn)一步節(jié)省了芯片的使用空間。文獻(xiàn)[36]在2014年將全集成芯片技術(shù)成功應(yīng)用于對(duì)模擬犯罪現(xiàn)場(chǎng)樣本檢材的檢驗(yàn)。全過(guò)程包括制備特殊酶的反應(yīng)液用于DNA的提取，采用紅外非接觸式控溫技術(shù)完成PCR擴(kuò)增和高分辨的電泳分離方法在2 h內(nèi)完成了對(duì)樣本的準(zhǔn)確分型，并與傳統(tǒng)方法分型結(jié)構(gòu)一致。

全集成芯片原理結(jié)構(gòu)

1.微流控芯片DNA提取條件的優(yōu)化

對(duì)提取進(jìn)液量進(jìn)行篩選，包括提取過(guò)程中的水，NaOH，HCL以及最后沖洗的水和TE緩沖液的體積，通過(guò)控制變量法，分別設(shè)置不同的體積梯度和停留時(shí)間，進(jìn)行自動(dòng)化提取，按照正常的擴(kuò)增體系，并同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照進(jìn)行比較確定出最佳進(jìn)液量；對(duì)于提取進(jìn)液的管道可以設(shè)置多種不同的長(zhǎng)度并運(yùn)行自動(dòng)化提取流程，提取后取出芯片上的載體物質(zhì)進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增并檢測(cè)，通過(guò)比較不同長(zhǎng)度管道的擴(kuò)增效果確定出最佳管道長(zhǎng)度。

2.微流控芯片PCR擴(kuò)增與優(yōu)化

對(duì)芯片PCR材料進(jìn)行生物相容性驗(yàn)證是芯片PCR正常擴(kuò)增的前提，因?yàn)橐话阈酒慕Y(jié)構(gòu)是兩種以上的材料通過(guò)鍵和組成，在此過(guò)程中可能會(huì)有抑制物釋放出來(lái)從而影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增。直接將芯片的原材料剪取小塊，放入擴(kuò)增體系，加陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，擴(kuò)增檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立不添加原材料的陽(yáng)性對(duì)照，3個(gè)重復(fù)；分別用高溫浸泡的芯片材料和去離子水配置PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置正常去離子水為陽(yáng)性對(duì)照，3個(gè)重復(fù)；用去離子水沖洗鍵合芯片材料3次，配置PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置正常去離子水為陽(yáng)性對(duì)照，3個(gè)重復(fù)；對(duì)提取裝置最后的沖洗水進(jìn)行研究，配置PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置正常去離子水為陽(yáng)性對(duì)照，3個(gè)重復(fù)，對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行比較，如果熒光信號(hào)基本無(wú)差異則相容性良好。

微流控芯片PCR的實(shí)現(xiàn)重點(diǎn)在于對(duì)芯片材料屬性的研究和芯片擴(kuò)增體系的優(yōu)化兩部分。首先了解芯片的基本結(jié)構(gòu)，一般芯片腔室的實(shí)際溫度和PCR擴(kuò)增儀顯示的溫度有較大差別，所以需進(jìn)行芯片溫度校準(zhǔn)，以保證規(guī)定時(shí)間內(nèi)有足夠的退火溫度和延伸時(shí)間；由于芯片材料的不同，即使對(duì)芯片PCR沒(méi)有抑制作用，但是由于芯片比表面系數(shù)的增加，對(duì)蛋白酶的吸附逐漸增加，以及載體的存在，吸附會(huì)更明顯，所以通常對(duì)芯片進(jìn)行預(yù)處理，使內(nèi)壁和反應(yīng)體系隔絕，可以采用一定濃度的BSA、PEG進(jìn)行芯片涂布預(yù)處理。微流控芯片對(duì)PCR某些成分的吸附，會(huì)影響PCR的擴(kuò)增效果，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增體系中不同反應(yīng)液的分析和濃度調(diào)節(jié)，盡量改善擴(kuò)增效果。采用控制變量法，分別對(duì)不同成分設(shè)置濃度梯度，進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，并且同時(shí)設(shè)立常規(guī)檢測(cè)進(jìn)行比較；操作者可在擴(kuò)增體系中加入不同濃度梯度的BSA、PEG，并設(shè)立常規(guī)陽(yáng)性對(duì)照，3個(gè)重復(fù)進(jìn)行比較，從而確定出最佳擴(kuò)增體系。

綜上，縮短對(duì)樣本DNA提取，擴(kuò)增，純化，電泳檢測(cè)中任意環(huán)節(jié)所消耗的時(shí)間均可實(shí)現(xiàn)不同程度的法醫(yī)DNA的快速檢驗(yàn)。國(guó)內(nèi)外成熟的方法是使用商品化的提取試劑，快速試劑，或是通過(guò)將快速試劑與性能好的快速擴(kuò)增設(shè)備，電泳設(shè)備相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。但是本文認(rèn)為直接PCR會(huì)因?yàn)闃颖局懈鞣N潛在的未知抑制物影響酶的活性，缺乏定量步驟會(huì)影響DNA的分型結(jié)果，所以使用商業(yè)化直擴(kuò)試劑盒時(shí)，要嚴(yán)格按照試劑盒所規(guī)定的樣本量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。目前DNA-STR快速檢驗(yàn)主要適用于常規(guī)檢材，但對(duì)于一些疑難檢材，混合樣品，以及高度降解的檢材的使用仍然是個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，但是要明確：快速檢驗(yàn)的目的主要是協(xié)助公檢法處理一些棘手和特殊的案件，如處理案件性質(zhì)惡劣但必需在極其有限時(shí)間需要得到分型結(jié)果。雖然國(guó)外商業(yè)化的3種便攜式的全自動(dòng)快速檢驗(yàn)儀器已經(jīng)上市，但普遍存在的問(wèn)題是檢測(cè)成本過(guò)高，并且不能自主選擇樣本數(shù)，國(guó)內(nèi)普及困難。全集成微流控芯片技術(shù)是目前快速檢驗(yàn)研究的核心，即使芯片的適用具有一定的樣本選擇性，并且芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜，成本高，但是國(guó)內(nèi)的研究面臨的主要瓶頸是如何開(kāi)發(fā)配套的軟件來(lái)分析自制的微芯片的電泳結(jié)果。法醫(yī)DNA快速檢驗(yàn)需從檢測(cè)樣本數(shù)目的自主選擇、再檢測(cè)樣本能力以及疑難，混合樣本的角度出發(fā)，研制出我國(guó)國(guó)產(chǎn)的便攜式全自動(dòng)快速檢測(cè)儀器，并實(shí)現(xiàn)推廣普及。