聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。由1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。

數(shù)字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。

20 世紀(jì)末，Vogelstein 等提出數(shù)字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元至多包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法，光度法基于核酸分子的吸光度來(lái)定量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以檢測(cè)到熒光值對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)；數(shù)字PCR是最新的定量技術(shù)，基于單分子PCR方法來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量，是一種絕對(duì)定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。

數(shù)字PCR技術(shù)不斷發(fā)展，Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等廠家相繼推出技術(shù)較為成熟的數(shù)字PCR產(chǎn)品。

利用與核苷酸加入相關(guān)的pH變化對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行電學(xué)檢測(cè)能夠使得測(cè)試裝置小型化和具有更大的可移植性，并且降低成本。然而，當(dāng)前的檢測(cè)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的離子敏感場(chǎng)效應(yīng)晶體管（ion-sensitive field effect transistor, ISFET）方法依賴于在一種體積龐大的難以精密加工的參考電極上建立流體門控電勢(shì)，然而因其難以精密加工也就限制了進(jìn)行大規(guī)模平行反應(yīng)檢測(cè)的潛力。

在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校的研究人員展示了利用一種將pH不敏感性參考場(chǎng)效應(yīng)晶體管（reference field effect transistor, REFET）與微加工固態(tài)準(zhǔn)參考電極（quasi-reference electrode, QRE）相配套使用的方法能夠檢測(cè)實(shí)時(shí)的pH變化。最終的結(jié)果是研究人員開(kāi)發(fā)出一種0.18μm的絕緣體硅片鑄造的傳感器，這種傳感器利用鉑QRE建立一種pH敏感的流體門控電勢(shì)，并且利用一種聚氯乙烯（PVC）膜REFET能夠基于pH變化對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）進(jìn)行檢測(cè)。這種技術(shù)非常適合進(jìn)行商業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)，降低對(duì)ISFET pH檢測(cè)的包裝和制造需求，而且能夠大規(guī)模地進(jìn)行平行液滴測(cè)量，如監(jiān)測(cè)數(shù)字PCR中的反應(yīng)進(jìn)程。

研究人員詳細(xì)了闡明了一種實(shí)現(xiàn)這種目標(biāo)的方法所需的所有步驟。鑒于固態(tài)電極的pH敏感性，REFET設(shè)計(jì)已被人們使用。一種攜帶pH不敏感性膜的ISFET可用來(lái)監(jiān)控這種電極的pH反應(yīng)。之前的技術(shù)已展示了在ISFET上使用pH不敏感性層，如硅烷、緩沖水凝膠、聚對(duì)二甲苯和polyACE。然而，PVC提供一種有吸引力的替代性選擇，這是因?yàn)樗耙驯蛔C實(shí)的簡(jiǎn)單制造過(guò)程、良好的pH不敏感性和已知的與加有BSA的PCR的兼容性。總之，將一種pH敏感性電極與一種pH不敏感性REFET結(jié)合在一起的系統(tǒng)為在芯片上對(duì)生物反應(yīng)（如靶向檢測(cè)多種病原體的LAMP）進(jìn)行電學(xué)檢測(cè)提供一種機(jī)會(huì)。

總之，在這項(xiàng)新的研究中，研究人員開(kāi)發(fā)出一種對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行電學(xué)檢測(cè)的新技術(shù)。將一種場(chǎng)效應(yīng)晶體管與一種固態(tài)電極進(jìn)行結(jié)合會(huì)簡(jiǎn)化對(duì)大規(guī)模LAMP等生物反應(yīng)進(jìn)行ISFET pH檢測(cè)。通過(guò)將易于制造的固態(tài)微電極整合在一種芯片的表面上，就能夠單個(gè)地對(duì)液滴進(jìn)行測(cè)量，并且繪制出它們發(fā)生變化的性質(zhì)。可能從這種方法獲得巨大益處的技術(shù)包括數(shù)字PCR或數(shù)字LAMP，以及基于介質(zhì)上電潤(rùn)濕的液滴操縱而能夠開(kāi)展的檢測(cè)方法。人們可能利用這種方法開(kāi)展酶活性高通量分析，檢測(cè)靶核酸序列是否存在，或者通過(guò)酶反應(yīng)速率檢測(cè)靶生物分子是否存在等。這種方法能夠通過(guò)使用常見(jiàn)的金屬鍍膜技術(shù)和一種pH不敏感性的REFET進(jìn)行液滴測(cè)量和簡(jiǎn)化大規(guī)模液體測(cè)量。

原始出處：

Eric Salm, Yu Zhong?§, Bobby ReddyJr.?§, Carlos Duarte-Guevara?§, Vikhram Swaminathan?∥, Yi-Shao Liu⊥, and Rashid Bashir.Electrical Detection of Nucleic Acid Amplification Using an On-Chip Quasi-Reference Electrode and a PVC REFET.Anal Chem.2016