對(duì)單個(gè)人類(lèi)細(xì)胞的基因組進(jìn)行準(zhǔn)確的變異檢測(cè)和大范圍單倍體型分析一直以來(lái)都是測(cè)序領(lǐng)域的巔峰挑戰(zhàn)。單細(xì)胞測(cè)序使我們能在更高的分辨率下研究生命的機(jī)制。一方面，在像癌癥這樣的組織樣本中存在大量具有不同基因組類(lèi)型的單個(gè)細(xì)胞,因此需要分析單細(xì)胞水平基因組而不是大量細(xì)胞的平均值；另一方面，對(duì)于非常珍貴的細(xì)胞樣品，如人類(lèi)卵母細(xì)胞和循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs），單細(xì)胞測(cè)序具有無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)；此外，利用單細(xì)胞測(cè)序，還可以揭示細(xì)胞個(gè)體在特定時(shí)間的演化情況。

正常人類(lèi)單個(gè)細(xì)胞DNA含量為6.6pg，相對(duì)于測(cè)序所需的ug級(jí)相當(dāng)微量，并且獨(dú)一無(wú)二，“有些DNA一旦錯(cuò)過(guò)就不再”！因此單細(xì)胞測(cè)序的關(guān)鍵一環(huán)是全基因組擴(kuò)增(WGA)，常見(jiàn)的方法如，DOP-PCR、MDA、MALBAC等需要用DNA聚合酶對(duì)細(xì)胞基因組做大量的體外擴(kuò)增，然后構(gòu)建文庫(kù)進(jìn)行相對(duì)讀長(zhǎng)較短的高通量測(cè)序。這些方法有兩個(gè)明顯的缺點(diǎn)：1，聚合酶的錯(cuò)誤擴(kuò)增可以在基因組上產(chǎn)生成千上萬(wàn)的假陽(yáng)性。2，短的序列讀長(zhǎng)幾乎不包含任何單倍體類(lèi)型信息。

張鹍教授的團(tuán)隊(duì)近期在PNAS發(fā)表題為“Ultra-accurate Genome Sequencing andHaplotyping of Single Human Cells”文章給出了解決方案。研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)名為“SISSOR” (微流體反應(yīng)器法單鏈測(cè)序)的方法，用來(lái)進(jìn)行準(zhǔn)確的單細(xì)胞基因組測(cè)序和單倍體分型。

該方法是利用微流體處理器將單個(gè)細(xì)胞染色體DNA的正負(fù)雙鏈進(jìn)行分離，并將百萬(wàn)堿基大小的DNA片段隨機(jī)分割成大量的納升級(jí)的組分，用于擴(kuò)增和構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)同源染色體的互補(bǔ)雙鏈分別進(jìn)行獨(dú)立的測(cè)序。這樣就能夠進(jìn)行Long-range單倍體的組裝，并且還能利用冗余和單倍體型信息糾正測(cè)序錯(cuò)誤。據(jù)文章結(jié)果顯示，該方法的糾錯(cuò)能力可以將單細(xì)胞測(cè)序錯(cuò)誤率降低至10^-8，并且單倍體片段平均可組裝長(zhǎng)度為500kb，重疊群contig達(dá)到N50大于7 Mb。該方法性能可以進(jìn)一步提高，使其擴(kuò)增更均勻和比對(duì)更精確，能夠獲得精準(zhǔn)的單細(xì)胞基因組序列以及單倍體信息以滿(mǎn)足臨床對(duì)基因組測(cè)序的不同需求。

張鹍教授

微流體反應(yīng)器

微流體反應(yīng)器應(yīng)用于單細(xì)胞測(cè)序其實(shí)早有應(yīng)用，黃巖誼和謝曉亮教授為了精確檢測(cè)基因組變異，在2015年報(bào)道的emulsion WGA (eWGA)技術(shù)即是“emulsion+MDA+microfluidic Chip”的三位一體的結(jié)合，無(wú)論是擴(kuò)增的均勻性、基因組的覆蓋度還是假陽(yáng)性的比例都有明顯的改善。如果說(shuō)eWGA是單細(xì)胞測(cè)序的“CPU 1.0”，那么張鹍教授的方法進(jìn)行了巧妙的改進(jìn)，將其升級(jí)到了2.0時(shí)代。

2.0的顯著的改進(jìn)可以歸納為兩點(diǎn)：

1，基因組DNA變性成單鏈，并且是Mb級(jí)大片段；

2，將大片段通過(guò)均勻分布到24個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)小室中，分別擴(kuò)增建庫(kù)。這好比是做拼圖游戲，將整個(gè)240塊圖形，先區(qū)分成24個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域做10個(gè)圖形的拼湊，大大降低了組裝難度，并且Mb級(jí)別的大片段包含了大量單倍體型的信息；另外獨(dú)立小室的MDA反應(yīng)體系更接近單分子擴(kuò)增，同于eWGA的效果，能使擴(kuò)增均勻性得到大大提升。

圖: eWGA：在一個(gè)試管中，裂解單個(gè)細(xì)胞，然后與MDA反應(yīng)緩沖液混合。用于微流體交叉連接裝置的乳化生成均勻分布的微滴，進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增（來(lái)源文獻(xiàn)3）。

圖: SISSOR技術(shù)：?jiǎn)渭?xì)胞捕獲，進(jìn)行裂解，染色體DNA分子以KOH溶液(ALS)分離成單鏈形態(tài)。單股DNA分子在24個(gè)小室隨機(jī)分布。每個(gè)小室都被放入MDA反應(yīng)室。每小室里的擴(kuò)增分別收集出來(lái)，然后加工成單獨(dú)barcode的測(cè)序文庫(kù)。

研究人員使用SISSOR技術(shù)對(duì)人的PGP1纖維細(xì)胞系進(jìn)行了實(shí)測(cè)，結(jié)果顯示：

1. 單倍體組裝：通過(guò)將所有reads比對(duì)到參考基因組序列，能夠達(dá)到預(yù)期的將Mb級(jí)DNA片段可視化的呈現(xiàn)，并且能夠?qū)蓷l同源的姐妹單體上四條互補(bǔ)鏈區(qū)分開(kāi)來(lái)。

2. 提高測(cè)序精度：基于SISSOR的單鏈獨(dú)立小室的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，可以通過(guò)比較不同小室的單鏈碎片的單倍體類(lèi)型來(lái)確定互補(bǔ)鏈，并將不同小室的同源序列相互匹配來(lái)糾正測(cè)序錯(cuò)誤比率。

論文通訊作者張鹍教授表示，SISSOR是對(duì)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的一次突破，將測(cè)序準(zhǔn)確性提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。

對(duì)于SISSOR技術(shù)的應(yīng)用前景，張鹍教授介紹道：“這項(xiàng)技術(shù)潛在的應(yīng)用包括對(duì)患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)，以及對(duì)體外受精的健康胚胎進(jìn)行篩選，此外，利用該技術(shù)可以對(duì)經(jīng)過(guò)基因組編輯的人體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到治療的目的。”

隨著前不久“人類(lèi)細(xì)胞圖譜”計(jì)劃的開(kāi)展，單細(xì)胞測(cè)序的研究熱情必然持續(xù)高漲，SISSOR技術(shù)憑著其獨(dú)特的單倍體型分析優(yōu)勢(shì)，和超高的測(cè)序精度必然將成為人們爭(zhēng)相使用的技術(shù)。希望通過(guò)不斷的完善，為科研和臨床做出更大貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

1.Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology andApplications.

2.Ultra-accurateGenome Sequencing and Haplotyping of Single Human Cells.

3.Uniform and accurate single-cell sequencing based on emulsion whole-genomeamplification.

（文章來(lái)自：測(cè)序中國(guó) 作者：白云 科學(xué)網(wǎng)科學(xué)網(wǎng)轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）