數字核酸擴增和檢測方法可提供出色的靈敏度和特異性，并可以對目標核酸進行絕對定量。在這些方法中，數字聚合酶鏈反應（PCR）通常用于DNA擴增和絕對定量，其也是眾多數字化分析檢測方法的起源。dPCR由于其反應時間長且需要精細的溫度控制，因此對于POC應用并不理想。等溫擴增（如LAMP）提供了一種快速，低成本的選擇，利用同樣的數字化思路，dLAMP的出現和發展逐漸得到人們的關注。本推送主要介紹dLAMP的主要技術原理。

1.什么是LAMP及其技術原理

之前的推送一直沒有好好解讀LAMP的技術原理。環介導等溫擴增（LAMP）是用于DNA擴增的單管技術，與PCR相比，等溫擴增是在恒定溫度下進行的，不需要熱循環儀，因此可大大減少儀器的復雜度，更便于開發POCT儀器。該技術最早報道于2000年日本學者Notomi發表在Nucleic Acids Research的文章。一經發布，就受到了世衛組織WHO、各國學者和相關政府部門的關注，短短幾年，該技術已成功地應用于SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測中。截止到目前為止，文章被引超過5500次。

從原理上講，LAMP使用兩套或三套引物和一種具有復制活性以及高鏈置換活性的聚合酶，可在60–65°C的恒定溫度下擴增靶序列。通常，使用4種不同的引物來鑒定靶基因上的6個不同區域，從而大大提高了特異性。另外一對“環引物”可以進一步加速反應。由于這些引物作用的特殊性質，在LAMP中產生的DNA量明顯高于基于PCR的擴增。另一方面，引物的增加也使得LAMP引物設計變得更加困難，常常需要依賴第三方軟件和報道文獻進行輔助設計。

LAMP的擴增產物可以通過光度法進行檢測，LAMP反應溶液中作為擴增副產物的焦磷酸鎂沉淀可以通過肉眼輕松觀察，特別是對于較大的反應量，因此可用此開發肉眼讀出的POC傳感器。同時，LAMP也可通過測量濁度或通過使用嵌入染料（例如SYTO 9）進行熒光實時跟蹤反應。SYBR green等染料可以用于創建可見的顏色變化，而無需使用昂貴的設備即可用肉眼看到該顏色變化，或者可以通過儀器更準確地測量出響應。

LAMP的反應體系一般包括4條引物、Bst DNA聚合酶緩沖液、具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、甜菜堿、Mg₂SO₄等。LAMP檢測體系中基因的擴增和產物的檢測可一步完成，擴增效率高，可在30~60 min擴增10⁹~10¹⁰倍，特異性較高；同時反應過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg²⁺結合，產生副產物焦磷酸鎂。LAMP技術的主要原理是DNA在65 ℃左右可以處于動態平衡狀態，DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶，使鏈置換DNA的合成不停地自我循環。

2.什么是Digital LAMP

和Digital PCR類似，最早報道Digital LAMP也是利用物理腔室進行反應分隔，只不過Digital LAMP直接使用了當時成熟的微流控芯片。文章的作者有加利福尼亞大學伯克利分校的Luke P. Lee教授和Daniel T. Chiu教授，其都是該領域的絕對大咖。

數字化的本質是對LAMP反應體系的分割化，使得每個微小的反應腔室的核酸模板數少于或者等于1個。經過擴增之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號，通過計算熒光信號的比例和泊松公式計算出核酸分子的絕對數量。

文章另一個特點是使用一種叫做自數字化的微流控技術（self-digitization chip），這種技術常見于細胞捕獲（如循環腫瘤細胞的捕獲和分析）和化學合成中。根據文章報道，Digital LAMP能夠在70分鐘內完成整個檢測，最低可檢測20個拷貝的噬菌體DNA。

        之后的研究報道更多采用液滴微流控技術進行Digital LAMP，檢測靈敏度也達到了幾個拷貝。于此同時，Digital LAMP在細菌、病毒檢測上也逐步展開，甚至逐步拓展到其它體外診斷領域。其中最為出名的是Rustem F. Ismagilov教授發到Science Translational medicine上的一篇文章，其使用Digital LAMP在30分鐘內完成了常規方法需要幾天的抗體敏感性實驗AST。

3.數字化核酸擴增的特點和平臺

準確度高

通過樣本的離散化，極微量的變異分子與正常分子被區分開來，使得稀有突變基因被單獨檢測，再通過陽性信號單元所占的數量和比例來精準地計算突變率或突變量。

靈敏度高

具有對低拷貝核酸分子數的區分能力，這是LAMP難以達到的。

絕對定量

以陽性信號和陰性信號微單元的數量及比例來確定原始樣本中目標核酸分子數，不需建立標準曲線即可進行精確定量。

不易受抑制劑的影響

通過分散到各個反應微單元，能夠有效降低了抑制劑對擴增的影響。

如今，商業化的dPCR平臺不斷面世，主要有Fluidigm公司的Bio-MarkTM高通量基因分析系統、Bio-rad公司的QX100和QX200微滴式dPCR系統、ThermoFisher公司的QuantStudioTM3DdPCR系統、RainDanceTechnologies公司的RainDropTMdPCR系統和Formulataix公司的ConstellationTMdPCR系統等。為了對比Digital LAMP與其它方法在檢測性能上的區別，研究者通過使用Bio-rad公司的微滴式dPCR系統和Fluidigm的Biomark 12.765 Digital Array平臺檢測人巨細胞病毒，結果顯示dLAMP具有更好的抑制劑抵抗力。

4.總結

數字化核酸擴增技術是一種高靈敏度、高準確度、高辨識力、高耐受性、可實現絕對定量分析的核酸分子診斷技術，是現有核酸診斷技術的補充，其所具備的應用優勢必將大大推動生物學研究、臨床診斷、食品安全和環境監測等領域的發展。同時，它也預示著一個擁有巨大潛能的新興產業和技術。dLAMP相對于dPCR速度更快，成本也更低，在dPCR難以實現POCT的情況下，不失為一個新的選擇。目前的數字化核酸擴增技術仍處于待完善階段，還存在許多不足之處。比較經典的Bio-rad液滴式dPCR系統由液滴發生器、PCR擴增儀和液滴信號讀取器3種設備配套組成，集成度差，儀器成本高，一般的實驗室難以承受。數字化核酸擴增技術的通量增高或者微單元體積縮小時，現有信號采集的方法難以做到簡便、快捷、準確，常需要后期繁瑣的信號處理與分析過程。但是，隨機技術的不斷進步，相信這些技術會逐步出現在體外診斷的各種產品中。

免責聲明：文章來源《 小桔燈網》微信公眾號 作者： 石頭道科普 以傳播知識、有益學習和研究為宗旨。 轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除。